Overexpression and knockdown of PBRM1 in clear cell renal cell cancer cell lines (ccRCC)

Van februari 2012 tot juli 2012 ben ik bezig geweest onder de supervisie van Dr. Klaas Kok bij de afdeling Genetica, UMCG. Ik heb mij bezig gehouden met de overexpressie en knockdown van PBRM1 in nier kanker cellijnen. Verder heb ik door middel van sequencing gekeken naar mutaties in het PBRM1 gen bij patiënten met het VHL-syndroom. Verder heb ik voor een pilot experiment met de drug Roscovitine, samen met een collega een opzet gemaakt om de DNA schade reparatie cascade te bestuderen (zie Samenvatting).

Op het lab heb ik leren omgaan met veel verschillende methoden, oa celkweek, bacterie kweek, isolaties, FACS, sequencen, westernblotting, competente cellen maken, enz. Tijdens mijn afstudeer periode hier op het lab heb ik ervaren hoe belangrijk collega’s zijn om je te helpen als je tegen problemen aanloopt en hoe belangrijk de gezelligheid op je werk is en hoe dat alles samen het heeft gemaakt tot een gezellig en voornamelijk leerzame periode.

Samenvatting

Clear cell Renal Cell Carcinoma (ccRCC) wordt gekenmerkt door het verlies van de korte arm van chromosoom 3. Op de korte arm van chromosoom 3 ligt het wel bekende VHL-gen, een tumorsuppressorgen. Tijdens eerdere onderzoeken zijn na sequencing van patiënten met ccRCC in 40-60% van de gevallen mutaties gevonden in het PBRM1-gen. Dit kan er op wijzen dat PBRM1 een tumorsuppressorgen is wat betrokken is bij de ontwikkeling van heldercellige niertumoren. Het doel van dit afstudeeronderzoek was het genereren van een knockdown van PBRM1 in HEK293T cellen. Deze knockdown werd gedaan door twee shRNA constructen in combinatie met een lentivirale vector. De knockdown was 40-80% op basis van het RNA niveau in de cellen. Tijdens dit onderzoek is ook geprobeerd een overexpressie van het PBRM1-gen te genereren in RCC4 cellen. Dit werd gedaan door middel van de pBABE-puro vector met het volledige coderende DNA voor BAF180. De RCC4 cellen ondervonden extreem veel stress door deze overexpressie waardoor een positieve selectie niet kon worden uitgevoerd. Met het uitvoeren van de RT-PCR zal ook RNA gemeten worden van niet getransfecteerde cellen.

De overexpressie van PBRM1 lijkt ook van invloed te zijn op het TBP huishoudgen, wel is hierbij een overexpressie van PBRM1 gemeten van 100%. Dezelfde RT-PCR data gemeten met het GAPDH huishoudgen gaf een overexpressie van PBRM1 van ongeveer 50% weer. Door de toevoeging van de drug Roscovitine aan HK2 cellen behandeld met een siRNA pool tegen PBRM1 werd er gekeken naar het effect van een knockdown van PBRM1 op de eiwitten betrokken bij DNA schade herstel. Met behulp van RT-PCR en western blotting werd gekeken of de knockdown van PBRM1 effecten heeft op p53, p21 en MDM2. Uit de RT-PCR data blijkt dat de expressie van p53 en p21 niet omhoog gaan. Over MDM2 kan geen uitspraak gedaan worden. Op eiwit niveau kan geen uitspraak worden gedaan over de expressie dit door niet functionele antilichamen. Bij twaalf patiënten met het VHL-syndroom is gekeken naar mutaties in het PBRM1-gen door middel van sequencing. Er zijn een aantal nucleotide veranderingen waargenomen, deze gaven geen aminozuur verandering. Over een aantal exonen kan geen uitspraak worden gedaan door niet functionerende primers.