Aantonen van mutaties in de tumorsuppressorgenen PBRM1 en SETD2 in clear cell Renal Cell Carcinoma (ccRCC)

Als afronding van de opleiding Biologie en Medisch laboratorium onderzoek heb ik 10 maanden stage gelopen op de afdeling Genetica.
Ik wist al vrij snel tijdens mijn opleiding dat mijn interesse ligt in de Genetica. Hiernaast leek kankeronderzoek mij ook erg interessant. Natuurlijk ben ik ook zoek gegaan naar een stage plek met een combinatie van beiden en die had ik vrij snel gevonden op deze afdeling, binnen de nierkanker groep van Dr. Klaas Klok. De collega’s zijn vriendelijk en altijd even behulpzaam en er is een goede werksfeer. Ook wordt er veel aandacht gegeven aan stagiaires en mijn ervaring is dat je wordt uitgedaagd om mee te denken aan het onderzoek.

Angela Kuik, maart 2012

Samenvatting (stage)

Aantonen van mutaties in de tumorsuppressorgenen PBRM1 en SETD2 in clear cell Renal Cell Carcinoma

Clear cell Renal Cell Carcinoma (ccRCC) is de meest voorkomende nierkanker en wordt gekarakteriseerd door verlies van een deel of de gehele korte arm van chromosoom 3. Bij de ontwikkeling van ccRCC lijken tumorsuppressorgenen betrokken te zijn. VHL is een dergelijk tumorsuppressorgen en is in 30-50% van de ccRCC gevallen gemuteerd. Tijdens een eerder onderzoek door deze groep is er Exome Sequencing uitgevoerd op de korte arm van chromosoom 3 in primair RCC DNA. Uit dit onderzoek zijn een aantal mutaties naar voren gekomen in de VHL, PBRM1 en SETD2 genen. Het doel van mijn onderzoek was het valideren van 7 mutaties in PBRM1 in primaire tumoren en 2 mutaties in SETD2 in primaire tumoren met behulp van een tweede methode, Sanger sequencen. Vervolgens was het doel te onderzoeken of er mutaties aanwezig zijn in 10 op het lab aanwezige RCC cellijnen en in 8 familiaire RCC tumoren. Om deze doelen te bereiken zijn er primers ontwikkeld voor de 19 exonen van het PBRM1 gen. Deze primers zijn geoptimaliseerd, waarna er PCR reacties zijn uitgevoerd op het primaire RCC DNA, RCC cellijn DNA en familiaire RCC DNA. SETD2 primers waren al aanwezig en met deze primers zijn PCR reacties uitgevoerd op het primaire RCC DNA. De gevormde producten zijn gesequenced, waarna deze geanalyseerd konden worden met behulp van het programma Mutation Surveyor. De 7 mutaties in PBRM1 in de primaire RCC tumoren zijn op deze manier terug gevonden. De 2 SETD2 mutaties bleken in beide gevallen in meerdere tumoren voor te komen, wat betekend dat dit polymorfismen zijn. In een eerder onderzoek zijn er in 40% van de onderzochte gevallen mutaties gevonden in PBRM1; tijdens dit onderzoek zijn er 5 mutaties gevonden in het PBRM1 gen in de 10 RCC cellijnen. Ook is er gekeken naar 8 familiaire tumoren. Hier is tot nu toe nog niets uitgekomen. Door een slechte kwaliteit van het DNA waren de verkregen sequenties niet analyseerbaar. Voor deze tumoren is verder onderzoek nodig. Het doel van het vervolgonderzoek zal zijn het naar beneden brengen van PBRM1 expressie in HEK (Human Embryonic Kidney) cellen met behulp van small interfering RNA (siRNA) en het effect hiervan op de cel te volgen. Als dit doel bereikt is, dan is de volgende stap de expressie van PBRM1 omlaag te brengen in gezonde niercellen en in deze cellen het effect hiervan te volgen.

Samenvatting (Afstudeerstage)

PBRM1 knockdown in HEK293T en HK-2 cellen. Een functionele analyse van een mogelijk tumorsuppressorgen

Clear cell Renal Cell Carcinoma (ccRCC) wordt gekarakteriseerd door verlies van een deel of de gehele korte arm van chromosoom 3 en bij de ontwikkeling van ccRCC lijken tumorsuppressorgenen betrokken te zijn. Tijdens eerdere onderzoeken zijn na sequencing in 40% tot 60% van de onderzochte ccRCC gevallen mutaties gevonden in het PBRM1 gen, waardoor dit een mogelijk tumorsuppressorgen lijkt te zijn dat betrokken is bij de ontwikkeling van ccRCC. Het doel van dit afstudeeronderzoek was te onderzoeken wat het effect van de knockdown van het mRNA van het PBRM1 gen is in de niercellijnen HEK293T en HK-2. Dit is gedaan met behulp van transfectie met siRNA. De knockdown was 50-85%, op basis van het RNA niveau in de cel. Op eiwit niveau is dit nog niet bevestigd vanwege een niet optimaal functionerend anti-PBRM1 antilichaam. Vervolgens is de groei van getransfecteerde cellen gevolgd met behulp van de alamarBlue® assay. Uit deze data blijkt dat deze knockdown een verlaging in de groei lijkt te veroorzaken.

Met behulp van een genexpressie assay is een genexpressie profiel gemaakt van de cellen voor en na transfectie. Deze analyses brachten geen grote verschillen in genexpressie aan het licht ten gevolge van de PBRM1 knockdown.