Promotie M. Sigmund

Peroxygenases and oxygenases within the tautomerase superfamily

Investigation, Engineering and the Application in an Enzymatic Cascade

Verbetering enzymale peroxygenaseactiviteit

Oxygenases en peroxygenases nemen op stereo- en regioselectieve wijze zuurstof uit de milieuvriendelijke oxidanten O₂ respectievelijk H₂O₂ op in hun organische substraten. Hoewel de meeste oxygenases en peroxygenases een cofactor gebruiken, zijn er enkele bijzondere enzymen ontdekt die in staat zijn oxygenatiereacties te katalyseren zonder gebruik te maken van een cofactor. De cofactor-onafhankelijke oxygenases en peroxygenases die tot op heden bekend zijn, zijn echter onvoldoende onderzocht.

In haar proefschrift beschrijft Marie Sigmund haar onderzoek naar één tautomerase superfamilielid met oxygenaseactiviteit, RhCC uit Rhodococcus jostii, en één tautomerase superfamilielid met promiscue peroxygenase activiteit, 4-oxalocrotonaat tautomerase (4-OT) uit Pseudomonas putida.

Sigmund: 'Door geselecteerde enzymen homoloog aan RhCC te screenen ontdekten we Rhop3 van Rhodococcus opacus met een driemaal zo hoge oxygenaseactiviteit. We hebben echter aangetoond dat de oxygenaseactiviteit van Rhop3 afhankelijk is van metaalionen, waardoor dit enzym dus niet als cofactor-onafhankelijk kan worden beschouwd.

Verder presenteren we een overzicht van enzymen met peroxygenaseactiviteit die in de natuur beschikbaar zijn en bespreken we enzymengineering-strategieën, die zijn toegepast om hun peroxygenaseactiviteit te verbeteren.

Met behulp van gerichte evolutie hebben we de promiscue peroxygenaseactiviteit van een tandem-gefuseerde enzymvariant van 4-OT ongeveer 150-keer verbeterd ten opzichte van 4-OT wild-type, wat de efficiënte synthese van α,β-epoxy-aldehyden op gramschaal met hoge enantioselectiviteit mogelijk maakt. Vervolgens hebben we het verbeterde cofactor-onafhankelijke peroxygenase toegepast in een één-pot multi-enzymatische cascade om enantio-verrijkte epoxiden en triolen te synthetiseren uit biomassa-afgeleide uitgangsmaterialen.'

Promotors: prof. dr. G.J. (Gerrit) Poelarends, prof. dr. ir. M.W. (Marco) Fraaije